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本制品是基于染料法荧光定量RT-PCR原理开发的用于轮状病毒研究检测的试剂盒。

轮状病毒(Rotavirus)是一种RNA病毒，主要侵犯婴幼儿，主要传播途径为粪、口传播，也存在呼吸道传播的可能性。该病毒潜伏期2～3天，最后引起轮状病毒腹泻和呕吐等急性胃肠炎为主要表现的临床症状。轮状病毒腹泻是世界性的传染病，全世界因急性腹泻病而住院的儿童中50%～60%是轮状病毒腹泻，每年有1.3亿婴幼儿患轮状病毒腹泻，全世界每年大约有90万儿童因感染轮状病毒而死亡，因此灵敏快捷检测轮状病毒具有重要的意义。

1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，只需要提供RNA样品。
   
2. 基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10～100倍，可以达到至少100拷贝/反应。
   
3. 根据轮状病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性，不会跟其它生物的RNA发生交叉反应。
   
4. 使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
   
5. 本制品既可用于定性检测，也可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少有5个数量级。
   
6. 本制品足够50次20μL体系的RT-PCR反应。
   
7. 只能用于科研，不能用于临床。

1. 引物干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入110μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。
   
2. 阳性对照需要单独放置。

1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
   
2. 换枪头，在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
3. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在4号管中加入5μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁴拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
5. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

6. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上得到的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的样本起始体积一样)。可以用水作为制备的阴性对照。
   
7. 用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒样品RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

8. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
   
9. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：
   

   成分	样品管 N+2个	RT-PCR 阴性对照	RT-PCR阳性 对照(1～6管)
   2×SYBR qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各10μL
   轮状病毒通用RT-PCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
   N+2个RNA模板	6μL	不加	不加
   自备超纯水	不加	6μL	不加
   6个阳性对照稀释液	不加	不加	各6μL
   10×SYBR qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL

10. 上机后按下面参数进行RT-PCR。
    

    过程	温度	时间
    RT(逆转录)	50℃	30分钟
    预变性	95℃	2分钟
    PCR反应 (35个循环)	95℃	15秒
    	60℃	15秒(采集SYBR通道的荧光信号)
    	72℃	15秒
    按仪器预设程序进行溶解曲线分析

    注意：循环次数最好不要超过35次。

11. 通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品(包括对照和待测样品)，归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
    
12. 如果两种阴性对照的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的qRT-PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
    
13. 如果两种阴性对照(样品制备阴性对照和qRT-PCR阴性对照)是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
    
14. 对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再换算出待测样品的RNA浓度。
    
15. 对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。